Forschungsreport
DNA-Fingerprinting zur Identifizierung von Obstsorten und -mutanten
Abschlussbericht: Kurzfassung
Förderkennzeichen: Projektnr.: 24 - 8251. 02 / 02 11 E
F. Ruess und M. Stark-Urnau
Staatliche Lehr- und Versuchsanstalt für Wein- und Obstbau, Abteilung Obst- und Weinbau
Juni 2000 bis Mai 2003
Problemstellung
Die Anbaumaterialverordnung für Obst, Gemüse und Zierpflanzen (AGOZ) vom 16.06.1998 regelt das Inverkehrbringen von Pflanzmaterial in diesem Bereich. Eine der Voraussetzungen für das Inverkehrbringen ist die hinreichende Sortenechtheit und Reinheit dieses Pflanzmaterials. Bisher wurde der Sortennachweis bei Obst über phänologische Bestimmungen durchgeführt, die zeitaufwändig und vegetations-gebunden sind.
Ziel
Durch die Verwendung von genetischen Fingerabdrücken mittels RAPD-PCR und Mikrosatellitentechnik soll die Sortenidentität der Kern- und Steinobstsorten des Basismaterials der Landesanstalt für Pflanzenschutz geklärt werden können. Parallel zur phänologischen Bestimmung einer Sorte sollen RAPD- und SSR-Marker festgelegt und eine leicht reproduzierbare PCR-Methode etabliert werden.
Untersuchungsmethode
Mit Hilfe des DNA-Fingerprinting-Verfahrens (RAPD-PCR-Technik und Mikrosatellitentechnik) können in einem Versuch indirekt viele DNA-Sequenz-Unterschiede in zu vergleichenden Genomen aufgedeckt werden. Anhand dieser Polymorphismen können die ent-sprechenden Obstsorten dann identifiziert werden.
Durch die Verwendung von DNA-Extraktionskits und PCR-Kits namhafter Firmen war die Einheitlichkeit der verwendeten Enzyme und Substanzen und in Folge dessen auch die Reproduzierbarkeit der Versuchsbedingungen gewährleistet.
Ergebnis
1. Vorbedingung für die PCR-Methoden ist die reproduzierbare Gewinnung reiner DNA. Der modifizierte Einsatz eines Extraktionskits der Firma Amersham Biosciences führte zur Gewinnung von reiner DNA. Die Reinheit dieser DNA wurde sowohl mittels Gelelektrophorese als auch im Spektrometer unter UV-Licht überprüft. Die Ratio A260/A280 betrug zwischen 1,6 und 2,2. Dies lässt auf reine DNA ohne Verunreinigungen durch Proteine schließen. Die neu etablierte Methode eignete sich für die Extraktion von DNA aus Apfelblättern und Apfelfrüchten als auch aus Blättern von Birne, Pfirsich, Kirsche oder Zwetsche.
2. Nach einem Vorscreening mit elf Apfelsorten und 26 Decamerprimern wurden drei Primer ermittelt, mit denen 135 Apfelsorten und fünf Mutanten ihr sortentypischer DNA-Fingerabdruck zu-geordnet werden konnte. Die drei Primer lieferten insgesamt 30 RAPD-Loci mit Fragmentlängen zwischen 470 und 1750 Basenpaaren. 25 RAPD-Loci (83,3%) wiesen Polymorphismen auf und die Fragmente, die von diesen Loci amplifiziert wurden, konnten als Marker für die Sortenidentifizierung verwendet werden. Parallel zu Apfelblättern wurden bei fünf Sorten auch Apfelfrüchte eingesetzt. Bei allen fünf Sorten erwiesen sich die DNA-Fingerabdrücke von DNA aus Blattmaterial mit der DNA aus Apfelfrüchten als identisch und die Methode kann analog für DNA aus Apfelblättern oder Apfelfrüchten eingesetzt werden.
3. Unter Verwendung von drei Primern wurden 48 Birnensorten molekular-genetisch charakterisiert. Es wurden insgesamt 29 RAPD-Loci mit Fragmentlängen von 550 bp bis 2000 bp ermittelt. 21 RAPD-Loci (72,4 %) wiesen Polymorphismen auf und konnten als Marker für die Sortenidentifizierung eingesetzt werden. Für 29 der 48 Genotypen war es möglich mindestens einen Primer zu finden, der einen sortentypischen Fingerabdruck lieferte. Die Kombination aller 21 RAPD-Marker reichte für die Identifizierung von 44 Birnensorten aus. Je nach Sorte bzw. Mutante wurden zwischen fünf und vierzehn RAPD-Marker ermittelt. Die untersuchten Mutanten ‘Conference’ und ‘Confer-ence 202’ sowie die ‘Williams Christ-Mutanten’ wiesen jeweils nur ein sortentypisches, nicht aber ein mutantentypisches Bandenmuster auf.
4. Neun Pfirsichsorten konnten mit drei RAPD-Primern differenziert werden, die 21 polymorphe RAPD-Loci lieferten. Je nach Sorte wurden zwischen acht und fünfzehn RAPD-Marker gefunden.
5. Bei Zwetschen erwiesen sich drei RAPD-Primer für die Identifizierung von 45 Zwetschensorten als geeignet. Lediglich zwei Mirabellenmutanten und drei Sorten Hauszwetschen ließen sich nicht differenzieren. Die drei Primer lieferten insgesamt 31 Fragmente im Bereich von 320-1505 Basenpaaren, von denen 21 (66%) polymorph waren und als Marker für die Sortendifferenzierung eingesetzt werden konnten.
6. Für 50 Süßkirschen und 12 Unterlagssorten wurde die Mikrosatellitentechnik zur Erstellung von DNA-Fingerabdrücken eingesetzt. Von zehn SSR-Primern wurden drei bei 12 Unterlagssorten eingesetzt und zwei bei 50 Süßkirschensorten. Die 12 Unterlagssorten konnten alle mit den drei SSR-Primern differenziert werden, die 27 polymorphe Marker lieferten. Von den 50 Süßkirschen konnten 44 mit zwei SSR-Primern differenziert werden, die 21 Sortenmarker lieferten.
Konsequenzen für die Praxis
Die Sortenidentifizierung von Apfel- und Birnen- Zwetschen- Pfirsich oder Kirschensorten kann innerhalb von sieben Tagen mit geringem
Aufwand an Material und technischen Geräten erfolgen. Ein großer Vorteil der Methode liegt darin, dass bereits zwei Blätter
oder ein Apfel für eine Analyse ausreichen.
Das DNA-Fingerprinting kann als zusätzliche Nachweismethode zum Sortennachweis dienen, indem DNA-Fingerabdrücke bereits
identifizierter Sorten mit den Fingerabdrücken unbekannter oder eventuell verwechselter Proben verglichen werden können.