Agrarforschung
Einsatzmöglichkeiten von DNA-Sonden-Tests in der Lebensmittelmikrobiologie am Beispiel der Untersuchung auf Listeria monocytogenes und Salmonellen

Tierhygienisches Institut Freiburg, Lebensmittelabteilung
Dr. Dirk Murmann, Dr. Elke Müller-Hohe                                                   
Juli 1992 - Juni 1993

Problemstellung

Beim Nachweis von Salmonellen in Lebensmitteln müssen umfangreiche Maßnahmen der Überwachungsbehörden eingeleitet werden. Dies gilt in Abhängigkeit von Produktgruppe und Keimgehalt auch für Listeria monocytogenes. Als Untersuchungsmethoden der Wahl liegen zur Zeit die Methoden der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG vor. Danach ist für den Nachweis von Listeria monocytogenes ein Zeitaufwand von 6 Tagen beim qualitativen Nachweis (Anreicherung) und vier Tagen beim quantitativen Nachweis anzusetzen. Beim Salmonellennachweis werden drei Tage bis zum Vorliegen eines negativen Ergebnisses und wenigstens vier Tage im positiven Fall benötigt. Zur Vereinfachung oder Verkürzung der genannten Untersuchungen wurde inzwischen mehrere Systeme entwickelt, darunter auch solche auf molekularbiologischer Basis (sog. Gensonden).

Ziel

Mit den durchgeführten Untersuchungen sollte geklärt werden, ob eine sichere Bestimmung von Listeria monocytogenes und Salmonellen mit Hilfe von Gensonden möglich ist, und ob sich die Untersuchungsdauer im Vergleich zu den amtlichen Methoden reduzieren läßt, so daß weitere Maßnahmen der Überwachungsbehörden schneller als bisher eingeleitet werden können.

Untersuchungsmethode

Beim Nachweis von Listeria monocytogenes wurde die Eignung sowohl eines miniaturisierten Testsystems auf der Basis von Stoffwechselleistungen als auch von zwei Gensondenverfahren als Kulturbestätigungstest überprüft.

Für den Nachweis von Salmonellen wurde die Eignung einer Gensonde zur Bestimmung direkt aus der Anreicherung überprüft. Weiterhin wurde die Bedeutung des Citratzusatzes zur Komplexbildung mit den im Anreicherungsmedium enthaltenden Magnesium-Ionen in Abhängigkeit von verschiedenen Salmonellenzahlen in der Anreicherungskultur untersucht.

Ergebnis

Mit dem Verfahren nach § 35 LMBG wurden aus 103 Lebensmitteln tierischer Herkunft Listerien isoliert, die in 59 Fällen als Listeria monocytogenes identifiziert wurden. Die Diagnosen wurden mit den eingesetzten Gensonden und dem API-Listeria-Test jeweils bestätigt. Die Ergebnisse liegen beim API-Listeria nach 24 Stunden, bei den Gensonden nach 30 Minuten (GenProbe AccuProbe L.m.) bzw. 2 ½ Stunden (Gene-Trak-Assay) vor.

Die in den Versuchsreihen eingesetzten Salmonellenkulturen wurden bei genauer Befolgung der vom Hersteller angegebenen Arbeitsanweisung sicher identifiziert. Dabei kann bereits zwei Tage nach Beginn der Untersuchung das Vorkommen von Salmonellen sicher ausgeschlossen werden.

Bei Verwendung des Rappaport-Vassiliades-Mediums zur Hauptanreicherung empfiehlt sich der Einsatz von Citrat. Bei ausreichend hohen Salmonellenzahlen von 107 KBE/g in der Anreicherungskultur kann auf die Zugabe von Citrat verzichtet werden. Bei Keimzahlen von 105 KBE/g ist ohne Citrat ein Salmonellennachweis mit der Gensonde nicht mehr zu führen.

Konsequenzen für die Praxis

Die überprüften Methoden sind bisher nicht als amtliche Methoden anerkannt. Die vorliegenden Untersuchungsergebnisse weisen nicht darauf hin, daß die Zuverlässigkeit der Verfahren schlechter ist

als bei amtlichen Methoden. Zweifelhaft ist, ob diese Verfahren zur Untersuchung amtlicher Proben mit denen sich aus den Ergebnissen ergebenen rechtlichen Konsequenzen herangezogen werden können. Aufgrund des zeitlichen Vorteils, der sich bei Verwendung von Gensonden im Vergleich zu den amtlichen Methoden ergibt, wird diese Technik jedoch zunehmend an Bedeutung gewinnen. Insbesondere bei großer Probenzahl oder als Screening-Methode im Rahmen der Eigenkontrolle von Herstellerbetrieben liegt der zeitliche Vorteil auf der Hand. Eine Überprüfung eines positiven Befundes der amtlichen Methode und Serotypisierung bei der Salmonellendifferenzierung kann ohne weiteres angeschlossen werden. Daher kann die Anwendung dieser Methoden befürwortet werden.

Literatur: Abschlußbericht

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