Forschungsreport
Pilotproduktion eines mikrobiellen Pflanzenstärkungsmittels zum Einsatz gegen den Feuerbranderreger im Obstbau

Förderkennzeichen: MLR 0210E

Dr. Stefan Kunz
Bio-System GmbH, Konstanz
Juni 2000 – Dezember 2000

Kurzfassung:

Problemstellung

Der Feuerbranderreger Erwinia amylovora befällt rosenblütige Obst- und Ziergehölze (Michel, 1995). Diese Bakteriose kann vor allem im Erwerbsobstbau große Schäden verursachen. Befallene Bäume müssen zurückgeschnitten oder gerodet werden. Zur Bekämpfung der Feuerbrandkrankheit war in Deutschland von 1994-1998 das Antibiotikum Streptomycin mittels einer Sonderverfügung im Erwerbsobstbau zugelassen (Backhaus und Klingauf, 1998). Nachdem 1999 kein Streptomycin eingesetzt werden durfte, wurde das streptomycinhaltige Präparat Plantomycin im Jahr 2000 als Pflanzenschutzmittel für den Zeitraum von 3 Jahren zugelassen. Der Einsatz von Antibiotika in der Landwirtschaft ist aber weiterhin umstritten und eine Verlängerung der Zulassung über diesen Zeitraum hinaus ist sehr fraglich. Deshalb werden im Erwerbsobstbau dringend alternative Bekämpfungsmethoden benötigt. Neben sauren Gesteinsmehlen und Pflanzenextrakten, wurden mit bakteriellen Antagonisten gute Bekämpfungserfolge erzielt (Backhaus und Klingauf, 1998; Zeller, 1999).

Der Bacillus subtilis Stamm BD170 (BsBD170) kann den Feuerbrandbefall von Obstgehölzen verringern (Zeller und Wolf, 1996; Laux et. al, 1999) . Deshalb soll dieser Stamm großtechnisch vermehrt, formuliert und als Pflanzenstärkungsmittel im Obstbau eingesetzt werden. Die Wachstumsbedingungen (Temperatur, pH, Zusammensetzung des Mediums) für BD170 im Schüttelkolben wurden bereits ermittelt. Die Bedingungen müssen auf Produktionsanlagen übertragen werden. Der erste Schritt dieses Scale-up ist die Etablierung der Wachstumsbedingungen in einem Laborfermenter, dessen technische Ausstattung mit industriell genutzten Produktionsfermentern vergleichbar ist.

Zur Qualitätssicherung wurde bisher nach der Anzucht und dem Trocknen der Kultur die Konzentration von Bs BD170 Sporen im Pulver auf Agarplatten bestimmt und auf eine Endkonzentration von 2x10 10 Sporen/g eingestellt. Dies reicht für die Genehmigung des Produktes nicht aus. Es muss nachgewiesen werden, dass keine anderen Mikroben, vor allem Humanpathogene, im Endprodukt vorhanden sind. Da BsBD170 charakteristische Kolonien bildet, können auf den Agarplatten auch Kontaminanten erkannt werden. Allerdings nur wenn sie in hoher Konzentration vorhanden sind. Kontaminanten in niedrigen Konzentrationen werden von Bs BD170 überwachsen. Deshalb müssen Selektivmedien gefunden werden, die das Wachstum von Bs BD170 hemmen, das Wachstum anderer Bakterien aber zulassen.

Die Art Bacillus subtilis wird von der Berufsgenossenschaft Chemie in die Risikogruppe 1 eingestuft (Sichere Biotechnologie; Eingruppierung biologischer Agenzien: Bakterien; Merkblatt B 006; 8/98; erschienen im Jedermann-Verlag, Heidelberg). Beim Umgang mit den der Gruppe 1 zugeordneten Bakterien besteht nach dem Stand der Wissenschaft kein Risiko für Mensch und Tier. Trotzdem existieren über die in der Natur weit verbreitete Art B. subtilis auch einige Berichte darüber, dass bestimmte Stämme beim Menschen Infektionen oder Lebensmittelvergiftungen auslösen können (Boer und Diderichsen, 1991). Deshalb verlangen die Zulassungsbehörden folgende toxikologischen Untersuchungen für den verwendeten Stamm: Prüfung auf akute Toxizität an Ratten, orale, dermale und inhalative Verabreichung. Prüfung auf Haut- und Augenreizung an Kaninchen. Untersuchung auf sensibilisierende Wirkung am Meerschweinchen.

Die Ziele dieses Forschungsvorhabens waren der Aufbau einer standardisierten Pilotproduktion für ein mikrobielles Präparat zum Einsatz gegen den Feuerbranderreger im Obstbau, die Einführung der von der Zulassungsbehörde verlangten Qualitätssicherung und Durchführung von toxikologischen Untersuchungen am Endprodukt.

Die im Schüttelkolben etablierten Wachstumsbedingungen (Medium: 2,5% Saccharose, 0,25% Hakaphos grün, 100mM Kaliumphosphatpuffer in Leitungswasser. Temp.: 27°C. Inkubationszeit 72h) mussten auf den Laborfermenter übertragen werden. Für das Endprodukt werden Sporen von Bacillus subtilis BD170 benötigt. Deshalb müssen die Fermentationsbedingungen nicht nur auf ein maximales Zellwachstum sondern auch auf einen hohen Versporungsgrad optimiert werden.

Die Fermenterläufe wurden mit einem Labfors (Firma Infors) mit einem 10l Gefäß (Nutzinhalt: 9l) ausgestattet mit pH-Regelung und Schaumsonde mit automatischer Antischaumdosierung durchgeführt. Die pO 2 -Regelung erfolgte über die Rührerdrehzahl.

Der Fermenter wurde mit einer 16-18h alten Vorkultur, die im Schüttelkolben in oben genanntem Medium angezogen wurde, mit einer Konzentration von 1:100 angeimpft. Wachstum und Sporenbildung wurden durch regelmäßige Probenahme überwacht. In den Proben wurde die OD bei 660nm gemessen, die Gesamtzellzahl und der Anteil an Sporen mikroskopisch bestimmt. Zur Bestimmung der Konzentration hitzeresitenter Sporen wurden die Proben für 10 min auf 75°C erhitzt und auf NB-Medium (0,8% Nutrient Broth, 5% Saccharose, 2% Agar) ausplattiert.

Sporenhaltige Suspensionen wurden nach der Fermentation abzentrifugiert (20.000 g). Die Pellets wurden in entionisiertem Wasser resuspendiert, mit 20% Magermilchpulver (w/v) versetzt, bei –20°C eingefroren und gefriergetrocknet. Alliquots der daraus resultierten Pulver wurden zur Besitmmung der Konzentration hitzeresistenter Sporen in 0,6% NaCl resupendiert, und auf NB-Medium ausplattiert.

Die Auswirkung verschiedener Antischaummittel oder der Kalziumkonzentration im Medium auf die Sporenbildung wurde im Schüttelkolben überprüft. Diese wurden mit einer Vorkultur 1:100 angeimpft und bei 27°C 72h geschüttelt.

Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae sind gramnegative, Oxidase-negative Stäbchen, die Glucose fermentieren und Nitrat zu Nitirt reduzieren. Enterobakterien können auf Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Dextrose-Agar (VRBD-Agar) nachgewiesen werden (Baumgart, 1999). Allerdings musste überprüft werden, ob die hohe Konzentration an B. subtilis im Präparat den Nachweis von Enterobakterien auf diesem Medium beeinträchtigt. VRBD-Agar wurde nach den Angaben des Herstellers (Fluka Chemie AG, CH-Buchs) hergestellt.

Für das Gussplattenverfahren (Baumgart, 1999) wurde der noch flüssige Nährboden nach dem Kochen und Abkühlen im Wasserbad auf 45 °C gehalten. 1 ml der Probe wurde in einer sterilen Petrischale mit 20 ml flüssigem Medium gemischt. Für das Spatelverfahren wurde der VRBD-Agar in Petrischalen gegossen. Auf diese wurde nach dem Abkühlen 0,1 ml Probe mit einem Drigalskispatel verteilt. Die Platten wurden 24 Stunden bei 37 °C inkubiert.

Als Testorganismus wurde der E-Coli Stamm DSMZ498 eingesetzt, der auf VRBD Medium in Abwesenheit von B. subtilis typische dunkelrote Kolonien bildet. Der Stamm wurde in Pepton-Boullion angezogen und bei 4°C gelagert.

Fermentersuspensionen wurden zum Nachweis von Enterobakterien unverdünnt auf VRBD-Medium ausplattiert (2x50µl). Daraus ergibt sich eine Nachweisgrenze von 10 Enterobakterien pro ml Suspension. Vom fertigen Präparat wurde 1g in 9ml 0,6% NaCl-Lösung resuspendiert. Von dieser Suspension wurden 2 x 50µl ausplattiert. Dies ergibt eine Nachweisgrenze von 200 Enterobakterien pro g Präparat.

Nachweis von Bacillus cereus

Kolonien von Bacillus cereus und Bacillus subtilis unterscheiden sich auf Mannit-Eigelb-Polymyxin-Agar (MYP). Die Zusammensetzung von MYP entspricht dem Basisagar des Cereus-Selektiv-Agar nach MOSSEL (Rezeptur s. Merck Mikrobiologie Handbuch, Trockennährböden, Cereus-Selektiv-Agar nach MOSSEL). Dieser muss nach dem Autoklavieren auf 50°C abkühlen dann wurde 100.000 IE/l Polymyxin B (Oxoid) und 10% Eigelbemulsion (Oxoid) zugegeben.

Verschiedene Proben wurden mit dem Spatelverfahren ausplattiert. Die Platten wurden 24h bei 32°C inkubiert. B. cereus wurde für die Versuche in Pepton-Fleischextrakt-Bouillon bei 27°C angezogen.

Fermentersuspensionen wurden zum Nachweis von B. cereus um Faktor 100 verdünnt und auf MYP-Agar ausplattiert (2x50µl). Daraus ergibt sich eine Nachweisgrenze von 2.000 B. cereus pro ml Suspension. Vom fertigen Präparat wurde 1g in 9ml 0,6% NaCl-Lösung resuspendiert. Diese Suspension wurde um Faktor 50 verdünnt und auf MYP-Agar ausplattiert (2 x 50µl). Dies ergibt eine Nachweisgrenze von 10.000 B. cereus pro g Präparat.

Zur Durchführung der toxikologischen Untersuchung wurden hitzeresistente Sporen von Bs BD170 im Laborfermenter produziert und mit Magermilchpulver als Trägerstoff gefriergetrocknet. Die Konzentration an hitzeresitententen Sporen von Bs BD170 wurde wie unter 3.1 beschrieben bestimmt. Der Mittelwert aus 5 Bestimmungen wurde zur Berechnung der Konzentration herangezogen. Die Endkonzentration wurde durch Zugabe von Magermilchpulver auf 2x10 10 Sporen/g eingestellt.

Dieses Präparat wurde mit der Bezeichnung „ Bacillus subtilis BD170 WP" für die toxikologischen Untersuchungen am Österreichischen Forschungszentrum Seibersdorf GmbH verwendet. Dort wurden folgende Tests unter Berücksichtigung der GLP nach OECD- und EEC Richtlinien durchgeführt:

• Toxizität an Ratten, orale (OECD 401; 92/69/EEC, B.1) und inhalative Verabreichung (OECD 403; 92/69/EEC,B2).
• Prüfung auf Haut- (OECD 404; 92/69 EEC B.4) und Augenirritation (OECD 405; 92/69/EEC, B.5)an Kaninchen.
• Prüfung auf sensibilisierende Wirkung an Meerschweinchen (Buehler Test) (OECD 406; 92/69/EEC, B.6).

Zuerst wurde geprüft, ob das im Schüttelkolben verwendete Medium auch im Laborfermenter verwendet werden kann. Ein Fermenterlauf bei 27°C und 90% Sauerstoffsättigung ergab, dass auch im Laborfermenter unter diesen Bedingungen ca. 1x10 9 Sporen/ ml produziert werden können. Allerdings bildete sich durch die starke Belüftung viel Schaum, der über die Abluft aus dem Fermenter ausgetragen wurde, so dass am Ende der Fermentation nur noch 30% des Startvolumens vorhanden war. Versuche den Schaum in einem Absetzgefäß aufzufangen, und die Flüssigkeit wieder in den Fermenter zurückzupumpen scheiterten, da die Schaumbildung dadurch verstärkt wurde, und der Austrag zunahm. Deshalb musste für weitere Fermentationen ein geeignetes Antischaummittel gefunden werden.

Im Schüttelkolben wurde der Einfluss verschiedener Antischaummittel (Antischaum B (Siliconölemulsion, Sigma), Siliconöl DC200 (Fluka), Paraffinöl, Rapsöl) auf die Sporenbildung von Bs BD170 überprüft. Die Anzahl hitzeresistenter Sporen wurde durch die meisten eingesetzten Öle reduziert. Nur die Silikonölemulsion Antischaum B hatte keine negative Auswirkung auf die Sporenbildung. Deshalb wurde in den folgenden Fermentationen Antischaum B (10%) über eine Antischaumsonde dosiert. Dadurch konnte verhindert werden, dass Schaum über die Abluft ausgetragen wurde.

Ein weiterer Faktor der bei der Übertragung auf größere Anlagen oder auf andere Standorte zu klären war, ist die Wasserqualität, die für das Medium nötig ist. Im Schüttelkolben und im Fermenter wurde Leitungswasser verwendet. Die quantitative Zusammensetzung des Leitungswasser ist aber vom Standort abhängig. Das Medium ist besser zu definieren, wenn entionisiertes Wasser verwendet wird. Die Fermentation mit entionisiertem Wasser ergab mikroskopisch erkennbare Sporen. Diese waren allerdings nicht keimfähig. Während der Sporenbildung wird in den Zellen aerober sporenbildender Bakterien Dipliconsäure gebildet. Dipliconsäure, liegt in reifen Sporen als Calcium-Chelat vor. Deshalb ist Kalzium für die Ausbildung hitzeresistenter Sporen notwendig.

Im Leitungswasser in Konstanz waren 45mg/l Kalzium enthalten. Um zu überprüfen, ob bei Verwendung von entionisiertem Wasser Kalzium der entscheidende Mangelfaktor war, wurde in Schüttelkolben die Sporulation von BsBD170 in Medium mit Leitungswasser, entionisiertem Wasser oder entionisiertem Wasser mit 137mg/l CaCl (entspricht 45 mg/l Kalzium) verglichen.

Sowohl bei der Verwendung von Leitungswasser als auch bei entionisiertem Wasser + 137 mg CaCl war die Ausbeute 2x 10 9 hitzeresistente Sporen/ml. Die Verwendung von entionisiertem Wasser ohne Kalziumzugabe ergab 10 7 hitzeresistene Sporen/ml. Die weiteren Versuche wurden deshalb wieder mit Leitungswasser durchgeführt. Bei der Übertragung der Ergebnisse auf andere Anlagen, muss der Kalziumgehalt des jeweiligen Leitungswassers beachtet werden. Bei Verwendung von entionisiertem Wasser muss Kalzium zugesetzt werden.

Im Schüttelkolben musste dem Medium eine hohe Konzentration Phosphatpuffer zugesetzt werden, um zu verhindern, dass der pH-Wert während des Wachstums von Bs BD170 absinkt und dadurch das Wachstum gestoppt wird. Die Puffersalze sind aber ein erheblicher Kostenfaktor. Mit dem Laborfermenter besteht nun die Möglichkeit nach Bedarf Base und Säure zu dosieren um den pH-Wert auch ohne Pufferzugabe stabil zu halten. Versuche die Fermentation mit pH-Regelung zu fahren zeigten auch, dass die Sporulation ohne Puffer ca. 12h früher abgeschlossen ist. Die Ausbeute an hitzeresistenten Sporen war höher als mit Puffer.

Vorversuche unter Verwendung von Puffer im Schüttelkolben hatten gezeigt, dass die Sporulation bei 37°C schwächer war als bei 27°C, obwohl das Wachstum bei der höheren Temperatur wesentlich schneller war. Im ungepuffertem Medium im Laborfermenter erhält man auch bei 37°C einen Versporungsgrad von über 90%. Durch die Temperaturerhöhung ist die Fermentation bereits nach 40h beendet.

Die so gewonnene Fermentersuspension mit ca. 2 x 10 9 Sporen/ml konnte durch Zentrifugation aufkonzentriert und nach Zugabe von Milchpulver gefriergetrocknet werden. Pro Fermenterlauf können somit 0,8 kg BIOPRO produziert werden.

Abbildung 1: Verlauf von Temperatur, Sauerstoffsättigung, Rührerdrehzahl, pH und Sporenkonzentration bei der Fermentation von BsBD170 in ungepuffertem Medium bei 37°C im Laborfermenter (9l Nutzvolumen). Die Sauerstoffsättigung wurde über die Rührerdrehzahl (500 + 200) auf 40% gehalten. Der pH wurde durch Zugabe von von 2M NaOH oder 2M HCl im Bereich von 6,5-7,5 gehalten.

Zur Familie der Enterobakteriaceae gehören zahlreiche Genera, u. a. verschiedene humanpathogene und phytopathogene Arten der Gattungen Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella , und Erwinia . Durch den Gesamt-Enterobacteriaceen-Nachweis bei der Produktkontrolle wird eine umfassendere Aussage über die Qualität und die Reinheit des Produktes möglich. Die Eignung von VRBD-Agar für den Nachweis von E. coli als Vertreter der Enterobakterien bei einer dichten Begleitflora von B. subtilis wurde überprüft. Dazu wurden verschiedene Proben mit E-Coli DSMZ498 versetzt (Tab. 1).

B.subtilis bildet auch in hoher Konzentration ausgebracht auf VRBD-Agar keine Kolonien. Die hohe Anzahl an B. subtilis in BIOPRO und in der Zellsuspension stört das Wachstum von E-coli Kolonien nicht. Beim Gussplattenverfahren erhält man eine gleichmäßige Verteilung der Kolonien im Agar. Die Platten mit der unverdünnten Präparatmischung beinhaltet sichtbare Partikel, die aber die Auswertung nicht stören. Die Nachweisgrenze für Verunreinigungen von BIOPRO mit E-coli beläuft sich mit dem Gussplattenverfahren auf 10 Zellen/g. Mit dem Spatelverfahren sind die E-Coli-Kolonien durch einen Präzipitationshof klar zu erkennen. Die Nachweisgrenze bei diesem verfahren errechnet sich zu 200 Zellen/g.

Tabelle 1: Nachweis von E-Coli in Mischung mit B. subtilis BD170 auf VRBD-Agar.
10% Milchpuver, 10% BIOPRO (2 x 10 10 B. subtilis Sporen/g), und eine Zellsuspension mit 2 x 10 9 B. subtilis Zellen/ml wurden nach dem Gussplattenverfahren auf VRBD-Agar ausplattiert. Zusätzlich wurden die drei Proben mit je ca. 350 E-Coli Zellen pro ml versetzt und mit dem Gussplatten- und dem Spatelverfahren ausplattiert. Nach 24h wurde die Anzahl dunkelroter Kolonien gezählt.

Nachweis von Bacillus cereus

B. cereus ist ein aerobes, fakultativ anaerobes, sporenbildendes Stäbchen. Wie B. subtilis kommt er natürlicherweise vor allem im Erdboden vor und hat dementsprechend ähnliche Wachstumsansprüche. Einige Stämme von B. cereus bilden Toxine, die beim Menschen Durchfall oder Erbrechen auslösen können (Baumgart, 1999). Aufgrund der Verwechslungsgefahr beider Organismen muss sichergestellt werden, dass sich keine B. cereus Sporen im Endprodukt befinden.

Beim Nachweis von B. cereus mit MYP-Agar wird seine Fähigkeit, Lecithin abzubauen, genutzt. Diese Eigenschaft fehlt bei B. subtilis , der auf dem Medium wächst, jedoch ohne die typische Farbreaktion hervorzurufen. Eine hohe Begleitflora kann aber auch die typische Farbe von B. cereus auf dem Selektivmedium unterdrücken. Durch Ausplattieren von definierten Mischungen beider Organismen wurde die Nachweisgrenze für B. cereus im Präparat ermittelt.

Tabelle 2: Nachweis von B. cereus in Mischung mit B. subtilis auf MYP-Agar. Von einer Suspension mit 3,4 x 10 9 B. subtilis Sporen/ml wurde eine Verdünnungsreihe erstellt. Jeder Verdünnung wurden 1.000 Zellen von B. cereus zugegeben. Von jeder Mischung wurden 50µl mit dem Spatelverfahren auf MYP Agar ausgebracht. B. cereus wurde zur Kontrolle auf Pepton Agar ausplattiert.

Beide Organismen wachsen auf MYP-Agar und bilden dort ähnlich aussehende rosarote bis weiße, flache, leicht wellige Kolonien. Die Kolonien von B. cereus sind deutlich größer und sind von einem ausgedehnten Präzipitationshof umgeben. Deshalb sind die beiden Organismen in Mischung gut zu unterscheiden.

Bei hoher B. subtilis Sporenkonzentration (1,7 x 10 8 /Platte) wurde das Wachstum von B. cereus unterdrückt. Bei einem Hintergrund von 1,7 x 10 6 Sporen/Platte sind die B. cereus Kolonien aufgrund Ihrer Größe deutlich zu erkennen, auch wenn die typische Farbreaktion noch nicht auftaucht.

Das Präparat, welches 2 x 10 10 Sporen/g enthält, muss also zum Nachweis von B. cereus um Faktor 500 verdünnt werden, damit eine vermeintliche Kontamination auf der Platte zu sehen ist. Bei Ausplattieren von 50µl müssen mind. 10.000 B. cereus pro g Präparat enthalten sein, damit auf der Agarplatte eine Kolonie zu sehen ist.

Akute Toxizität an Ratten, inhalative Verabreichung: Alle Tiere überlebten die Inhalation der höchsten, technisch machbaren Konzentration von BIOPRO bis zum Ende des Untersuchungszeitraums von 14 Tagen. Es wurden keine nachteiligen Auswirkungen auf die Gesundheit der Tiere festgestellt.

Akute Toxizität an Ratten, orale Verabreichung: Bei zehn Versuchstieren traten bei einer Verabreichung von 2000 mg BIOPRO/kg Körpergewicht keine toxischen Effekte auf. Alle Tiere überlebten. Die LD 50,oral liegt also über 2000 mg/kg Körpergewicht.

Prüfung auf Hautirritation an Kaninchen: Bei drei Versuchstieren traten nach der dermalen Verabreichung von 0,5g BIOPRO keinerlei Hautreaktionen oder toxische Effekte auf. BIOPRO wird als nicht hautreizend eingestuft.

Prüfung auf Augenirritation an Kaninchen: Bei drei Versuchstieren trat nach der Verabreichung von 0,1ml BIOPRO eine reversible Rötung der Augen auf. Iris und Hornhaut wurden nicht geschädigt. Nach der Richtlinie 93/21/EEC ist BIOPRO nicht als reizend für die Augen einzustufen.

Prüfung auf sensibilisierende Wirkung an Meerschweinchen (Buehler Test): Es zeigten sich weder nach der Induktionsbehandlung noch nach der Auslösebehandlung mit BIOPRO Hautreaktionen bei den Versuchstieren.

Mit dem erarbeiteten Fermentationsprotokoll können Sporen des B. subtilis Stammes BD170 für die Produktion von BIOPRO gewonnen werden. Geringe Mengen für z. B. toxikologische Untersuchungen und für kleine Freilandversuche können mit dem Laborfermenter produziert werden. Die Daten werden auch für das Scale-up des Produktionsverfahrens benötigt.

Zum Nachweis von Kontaminationen in Fermentersuspensionen und im Präparat wurden zwei Testmethoden etabliert. Auf VRBD-Agar können Kontaminationen mit Enterobakterien und auf MYP-Agar Kontaminationen mit B. cereus nachgewiesen werden. In den bisher geprüften fünf Fermenterläufen wurde in einem Fall eine Kontamination mit Enterobakterien festgestellt. Eine Kontamination mit B. cereus konnte bisher nicht gefunden werden. Durch Verwerfung kontaminierter Fermentersuspensionen, kann ein sauberes Produkt mit gleichbleibender Qualität garantiert werden.

Die toxikologischen Untersuchungen ergaben keine Bedenken gegen den Einsatz des Präparates. Die Daten werden an die Zulassungsbehörden weitergereicht und sollten die Aufnahme von BIOPRO in die Liste über Pflanzenstärkungsmittel ermöglichen, das dann zur Feuerbrandbekämpfung eingesetzt werden könnte.

• Backhaus, G. F. und F. Klingauf (1998): Die Feuerbrandkrankheit und ihre Bekämpfung in der Bundesrepuplik Deutschland. Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. 50, 193-199.
• Baumgart, J. (1999): Mikrobiologische Untersuchung von Lebensmitteln. B. Behr`s Verlag, Hamburg
• Boer, A. S. d. und B. Diderichsen (1991): On the safety of Bacillus subtilis and Bacillus amyloliquefaciens: a review. Appl. Microbiol. Biotechnol. 36, 1-4.
• Laux, P., K. Hofer und W. Zeller (1999): Untersuchungen im Freiland zur Bekämpfung des Feuerbrandes mit bakteriellen Antagonisten. In: K. Pieber und G. Bedlan (eds.). 2. Symposium Phytomedizin und Pflanzenschutz im Gartenbau. pp. 53-54. Druckerei Lischkar & co., Wien.
• Michel, H. G. (1995): Der Feuerbrand gefährdet Obst und Ziergehölze. Landesanstalt für Pflanzenschutz, Stuttgart.
• Zeller, W. und B. Wolf (1996): Studies on biological control of fire blight. Acta Hort. 411, 341-345.
• Zeller, W. (1999): Zum Stand des Einsatzes von möglichen alternativen zum Plantomycin gegen den Feuerbrand. In: K. Pieber und G. Bedlan (eds.). 2. Symposium Phytomedizin und Pflanzenschutz im Gartenbau. pp. 55-56. Druckerei Lischkar & Co., Wien.

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