Agrarforschung
Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik

Dr. W. Hörtig, Chemische Landesuntersuchungsanstalt Freiburg
Oktober 1997 - September 1999

A. Nachweis gentechnisch veränderter Lebensmittel

Problemstellung

Mit der Gentechnologie vollzieht sich eine große Veränderung im Bereich der menschlichen Ernährung. Auf experimenteller Stufe ist es bereits gelungen, alle wichtigen Lebensmittel wie Getreide, Obst, Fisch und Nutztiere gentechnisch zu verändern. Die stabile Einführung neuer Gene in das Erbgut von Pflanzen mit Hilfe der Gentechnik ist mittlerweile auch zu einem wichtigen Verfahren der Pflanzenzüchtung und Hybridsaaten-Produktion geworden. Als neue transgene Eigenschaft spielen vor allem die Herbizid-, Fungizid-, Virus- und Insektenresistenz sowie die Reifungsverzögerung eine bedeutende Rolle. Als erste gentechnisch veränderte Pflanze erhielt in den USA im Jahr 1994 die Flavr-Savr™-Tomate eine Zulassung zum Anbau und zur Vermarktung als Nahrungsmittel. Seit dieser Zeit sind in den USA und Europa weitere gentechnisch veränderte Nutzpflanzen zugelassen worden, zum Beispiel die Glyphosatresistente Roundup-Ready-Soja, insektenresistenter Mais oder die reifungs-verzögerte Antimatsch - Tomate. Die EG-Verordnung über neuartige Lebensmittel regelt die Kennzeichnung für Lebensmittel, die mit Hilfe der Gentechnik hergestellt wurden. Eine Kennzeichnung solcher Lebensmittel ist immer dann erforderlich, wenn Unterschiede gegenüber herkömmlichen Lebensmitteln nachweisbar sind.

Ziel

Um den Verbraucher über die Herstellungsweise der Produkte informieren und die gegebenenfalls vorgeschriebene Kennzeichnung überprüfen zu können, sind geeignete Nachweisverfahren erforderlich. Im Rahmen des Forschungsvorhabens sollten daher für die Lebensmittelüberwachung geeignete molekularbiologische Arbeitstechniken und Verfahren eingeführt werden.

Untersuchungsmethoden

Gentechnische Veränderungen lassen sich am einfachsten auf DNA-Ebene nachweisen. Für einen spezifischen Nachweis eignen sich die Gene, die für die neue Merkmalsveränderung kodieren (Struktur-gene: z.B. Herbizidresistenz, Virusresistenz). Eine einfache Analysestrategie (Screening-Methode) ist der Nachweis von konstitutiven Promotoren (z.B. CaMV 35S Promotor) und Terminatoren (NOS-Terminator), die bei einer großen Anzahl transgener Pflanzen zu finden sind. Konstitutive Promotoren des Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) werden häufig eingesetzt um hohe Expressionsraten des neuen Gens zu gewährleisten. Marker- oder Reportergene werden häufig zusätzlich mit den Strukturgenen eingeschleust, damit die erfolgreich transformierten Pflanzenzellen leichter identifiziert werden können. In den meisten Fällen werden dafür Antibiotika- oder Herbizidresistenzgene eingesetzt. Diese Kontrollgene kommen in den unterschiedlichen Pflanzen gemeinsam vor und eignen sich daher besonders für Screeningverfahren. Promotoren, Reporter- und Markergene sowie Sequenzen, die für die jeweilige gentechnische Veränderung charakteristisch sind, lassen sich mit molekularbiologischen Methoden wie der Polymerasenkettenreaktion (PCR) und/oder Southern-Hybridisierung nachweisen. Wichtiger Bestandteil bei der Entwicklung von Methoden ist deren Erprobung bei gentechnisch verändertem Referenzmaterial.

Ergebnis

1. DNA-Extraktion

An verschiedenen gentechnisch veränderten Pflanzen (Tomaten, Mais, Zuckerrübe, Kartoffeln und Soja) und daraus hergestellten Produkten (Ketchup, Maismehl, Kartoffelchips usw.) wurden unterschiedliche DNA-Extraktionsverfahren ausgetestet und gegebenenfalls modifiziert. Die Qualität der DNA wurde durch Amplifizierung tier- bzw. pflanzenspezifischer DNA-Sequenzen überprüft. Zwei dieser Methoden zur DNA-Extraktion aus Sojalecithin bzw. Honigen (Pollen) wurden mittlerweile publiziert.

2. Qualitative PCR

Für den Nachweis der gentechnischen Veränderung wurde das Antibiotikaresistenzgen Neomycinphosphotransferase II (nptII), der 35 S Promotor, die Terminationssequenz NOS (Nopalinsynthase) und das jeweilige Strukturgen ausgewählt. Die im Rahmen des Forschungsvorhabens entwickelte Screening-Methode ermöglicht den Nachweis der meisten derzeit bekannten gentechnisch veränderten Pflanzen. Der Nachweis von gentechnischen Veränderungen ist auch in verarbeiteten Lebensmitteln möglich, vorausgesetzt es sind noch geringe Spuren der veränderten DNA vorhanden. Dies ist z.B. bei erhitzten (gekochten, gebratenen) Lebensmitteln der Fall. Die Screening-Methode wurde 1997 in der Zeitschrift "Deutsche Lebensmittel-Rundschau" und als englischsprachige Zusammenfassung in dem neu aufgelegten Heft des Bundesinstitutes für gesundheitlichen Verbraucherschutz publiziert. Dieses Verfahren ist mittlerweile in nationalen und internationalen Ringversuchen erprobt worden und ist als europäische Referenzmethode vorgesehen. In der Schweiz und in Deutschland wird die Screening-Methode als Referenzmethode zur Überprüfung der Kennzeichnungspflicht für gentechnisch veränderte Lebensmittel eingesetzt. Darüber hinaus wurden spezifische Verfahren zum Nachweis von gentechnisch veränderten Tomaten, Zuckerrüben sowie Mais und Raps entwickelt und in Ringversuchen erprobt. Eine Methode zum spezifischen Nachweis von herbizidresistentem Mais, Zuckerrüben und Raps wurde im Jahr 1999 publiziert.

3. Quantitative PCR

Zur Bestimmung von Anteilen an Roundup Ready Soja (RRS) in Zutaten aus Soja wurde die doppelt kompetitive PCR entwickelt. Mit dieser Methode kann anhand des Verhältnisses der jeweils ermittelten Kopienzahl für Soja- und RRS-DNA in den Probenansätzen auf den relativen Gehalt an RRS-Bestandteilen in den sojahaltigen Zutaten eines Lebensmittels geschlossen werden.

Die entscheidende Voraussetzung und gleichzeitig die größte Limitierung für die Anwendung dieses Verfahrens ist die Verfügbarkeit der internen Amplifikationsstandards. Diese müssen in aufwendigen molekularbiologischen Arbeitstechniken hergestellt und anschließend standardisiert werden. Deshalb ist bisher lediglich ein entsprechender Standard zur Quantifizierung verfügbar; weitere Standards für die Fülle der bereits jetzt zu quantifizierenden gentechnisch veränderten Nutzpflanzen (Mais, Raps etc.) müssen noch entwickelt werden.

B. Molekularbiologische Verfahren zum Nachweis von Tier- und Pflanzenarten

Problemstellung

Molekularbiologische Methoden lassen sich nicht nur zum Nachweis von gentechnisch veränderten Organismen, sondern auch zum Nachweis von Tier- oder Pflanzenarten sowie von Mikroorganismen in Lebensmitteln einsetzen. Bislang wurden Tier- und Pflanzenarten überwiegend mit proteinchemischen oder immunologischen Verfahren identifiziert. Bei erhitzten oder weitgehend verarbeiteten Erzeugnissen stoßen diese Methoden - bedingt durch die Denaturierung der Proteine - jedoch an ihre Grenzen. Die Vorteile molekularbiologischer Verfahren liegen in der vergleichsweise schnellen Durchführung bei gleichzeitig hoher Sensitivität und Spezifität. Die Verfahren eignen sich selbst bei stark erhitzten Produkten, da auch hier noch ausreichend lange, für die jeweilige Spezies charakteristische DNA-Bruchstücke vorhanden sind.

Ziel

Zur Differenzierung von Tier- und Pflanzenarten stehen mittlerweile eine Reihe von molekularbiologischen Methoden zur Verfügung. Bereits seit einigen Jahren wird das PCR-RFLP (Restriktions-fragmentlängenpolymorphismus) -Verfahren zur Tierartidentifizierung in Fleischerzeugnissen eingesetzt. Im Rahmen des Forschungsvorhabens sollen daher molekularbiologische Methoden zum Nachweis von Tier- und Pflanzenarten entwickelt bzw. an die Praxis der Lebensmittelüberwachung angepasst werden.

Untersuchungsmethode

1. PCR-RFLP

Bei der PCR-RFLP werden hochkonservierte Sequenzen aus der mitochondrialen DNA (Cytochrom b-Gene) ausgewählt. Innerhalb dieser Sequenzen befinden sich variable Abschnitte, die von Tierart zu Tierart verschieden sind. Wenn die konservierten Bereiche amplifiziert werden, resultieren bei allen Tierarten PCR-Amplifikate mit einheitlicher Größe. Der amplifizierte Genabschnitt wird anschließend mit Restriktionsenzymen im Bereich der variablen (inneren) Regionen geschnitten, so daß für die jeweilige Spezies charakteristische Restriktionsmuster entstehen (RFLP = Restriction fragment length polymorphisms). Anhand dieses Fragmentmusters können die unterschiedlichen Tierarten identifiziert werden.

Die bislang im Labor durchgeführten Experimente zeigen, daß auch in hocherhitzten Materialien die typischen Fragmente nachweisbar sind. Eine Identifizierung der Tierart in den Handelsproben ist mit Hilfe geeigneter Restriktionsenzyme auch bei Mischungen gut möglich. Eigene Untersuchungen zeigen, daß beispielsweise 1 % Rindfleisch in Schweinefleisch oder 0,1 % Schweinefleisch in erhitzten Rindfleischerzeugnissen sicher nach-gewiesen werden können. Die Empfindlichkeit und gleichzeitig universelle Anwendbarkeit der Methode zeigt sich auch in Käseproben und sogar in Kosmetika, wo eine Tierartbestimmung noch möglich ist. Zur Differenzierung sehr nahe verwandter Arten oder Subspezies kann ebenfalls der mitochondriale Cytochrom b-Genabschnitt herangezogen werden. Bei sehr geringen Sequenzunterschieden kann es jedoch schwierig werden, zur Differenzierung geeignete Restriktionsschnittstellen innerhalb des amplifizierten Abschnittes zu finden (z.B. Hausschwein - Wildschwein). Mit Hilfe der sog. PCR-SSCP-Technik lassen sich dagegen auch noch Punktmutationen nachweisen.

2. Artspezifische PCR

Ein weiteres Verfahren zur Tierartbestimmung in Fleischerzeugnissen ist der Nachweis artspezifischer Nukleinsäuresequenzen mit Hilfe der PCR. So wurde 1994 von einer Schweizer Arbeitsgruppe der Universität Bern der spezifische Nachweis von Schwein bzw. Rind in erhitzten Fleischerzeugnissen vorgestellt. Nach Extraktion der Nukleinsäuren erfolgt der spezifische Nachweis von DNA aus Schwein bzw. Rind mittels einer Amplifizierung (PCR) des artspezifischen Wachstumshormon-Gens.

Dieses Verfahren wurde im Rahmen des Forschungsvorhabens erfolgreich in die Praxis der Lebensmittelüberwachung eingeführt und etabliert. Mittlerweile existieren bereits eine Reihe von tierartspezifischen PCR-Verfahren, die den gezielten und schnellen Nachweis einer bestimmten Tierart ermöglichen.

3. PCR zum Nachweis von Pflanzenarten

Aufgrund der hohen Spezifität und Sensitivität etablieren sich die molekularbiologischen Methoden zunehmend auch in der Analytik pflanzlicher Lebensmittel. Ähnlich wie mitochondriale DNA in der Tierartbestimmung sind ribosomale Nukleinsäuren und Chloroplasten-DNA besonders zur genetischen Analyse geeignet. So wurde zum Beispiel eine Methode aus der Pflanzengenetik, die auf der Amplifikation ribosomaler Gene basiert, an die Anforderungen der Lebensmittelanalytik angepasst.

Mit Hilfe derartiger Methoden können Getreidearten in Lebensmitteln nachgewiesen und differenziert werden, z.B. bei Verfälschungen in verarbeiteten Getreideprodukten. Auch Soja, beispielsweise als Fremdeiweiß zugesetzt, kann mit Hilfe der PCR schnell und zweifelsfrei in erhitzten Lebensmitteln (Fleischerzeugnissen) nachgewiesen werden. Eine Reihe weiterer Methoden zum Nachweis von Weizen, Weichweizen, Raps und Mais wurden entwickelt und in die Routineanalytik eingeführt.

Konsequenz für die Praxis

Neben der Screening-Methode wurden eine Reihe weiterer Verfahren für den spezifischen Nachweis gentechnisch veränderter Lebensmittel entwickelt und in die Praxis der Lebensmittelüberwachung eingeführt. Für die Routineanalytik konnten somit geeignete Verfahren zum Nachweis gentechnisch veränderter Lebensmittel zur Verfügung gestellt werden. Durch die Optimierung von Methoden zur Extraktion von Nukleinsäuren (DNA) aus Lebensmitteln können die Nachweisverfahren auch bei verarbeiteten und zusammengesetzten Lebensmitteln eingesetzt werden. Eine quantitative Bestimmung von Anteilen gentechnisch veränderten Bestandteilen in Lebensmitteln ist mit Hilfe der kompetitiven PCR prinzipiell möglich. Die quantitative PCR wird bereits in der Routineanalytik zur Bestimmung von Anteilen gentechnisch veränderter Roundup Ready Soja in Lebensmitteln eingesetzt. Aufgrund des relativ hohen Aufwandes zur Entwicklung und Validierung der benötigten internen Standards sollte künftig insbesondere zur schnellen Entwicklung von Quantifizierungsmethoden bei gentechnisch veränderten Lebensmitteln verstärkt die sogenannte real-time PCR, die im Rahmen dieses Forschungsvorhabens noch nicht eingesetzt werden konnte, erprobt werden .
Zur Identifizierung von Tier- und Pflanzenarten in Lebensmitteln wurde bislang überwiegend die Spezifität der Proteine herangezogen. Mit dem PCR-Verfahren eröffnen sich nun neue Möglichkeiten bei dem Nachweis von Zutaten pflanzlicher oder tierischer Herkunft in erhitzten oder verarbeiteten Lebensmitteln. Eine Reihe von Methoden, die an der Chemischen Landesuntersuchungsanstalt Freiburg entwickelt und publiziert wurden, sind in Ringversuchen erprobt worden und werden mittlerweile als nationale und internationale Referenzmethoden eingesetzt.

Literatur
Abschlussbericht, Januar 2000

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