Forschungsreport
Coxiella burnetii bei Schafen

Förderkennzeichen: Projekt-Nr.0205E
Auftragnehmer: Tierärztin Nadja Breitling aus Metzingen
Projektleitung: Dr. Reinhard Sting, Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart

Kurzfassung:

Problemstellung

Q-Fieber, das durch den Erreger Coxiella burnetii (C. burnetii) hervorgerufenen wird, ist eine immer wieder auftretende klassische Zoonose, die in den letzten Jahren allgemein beim Menschen zugenommen hat (Hellenbrand et al., 2001; Kimmig et al., 2000, Reintjes et al., 2000, Robert Koch-Institut, 2002). So traten Q-Fieber-Epidemien in den letzten Jahren vor allem in Baden-Württemberg aber auch in Hessen und in Nordrhein-Westfalen auf (Hellenbrandt et al., 2001; Robert Koch-Institut, 2002, 2003a, 2003b; Universitätsklinikum Tübingen, 2002). Nicht allein die akuten Infektionen mit sehr schweren und teilweise tödlichen Verläufen sondern auch chronische Q-Fieber-Erkrankungen, denen durch Untersuchungen in Frankreich ein hoher Anteil von Herzbeschwerden angelastet wird (Fournier et al., 1998), können eine große Bedeutung bei der Gefährdung der Gesundheit des Menschen haben (Maurin, Raoult, 1999; Edlinger, 1987). Aufgrund gehäuft auftretender Q-Fieber-Erkrankungen im Großraum Tübingen (Universitätsklinikum Tübingen, 2002) und der im Vergleich zu anderen Bundesländern höchsten Prävalenz beim Menschen  von 1979 bis 1999 in Baden-Württemberg (Hellenbrand et al., 2001) kam es im Jahr 2000 zu einem Expertengespräch im Ministerium Ländlicher Raum Baden-Württemberg mit dem Ziel, Wege der Bekämpfung, Diagnostik und Prophylaxe des Q-Fiebers zu erarbeiten. Einigkeit bestand darüber, dass in Baden-Württemberg nicht nur dem Schaf sondern auch der Schafzecke (Zecken der Gattung Dermacentor) besondere Aufmerksamkeit als mögliche Infektionsquellen geschenkt werden muss.
Aktuelle Daten zum Vorkommen von C. burnetiiinfizierten Schafzecken sowie serologische Untersuchungen in Baden-Württemberg liegen bereits längere Zeit zurück und serologische Daten, die mittels der sensitiven ELISA-Technik ermittelt worden sind, fehlen vollständig.

Ziel

Ziel dieser Arbeit war es deshalb, Felduntersuchungen mittels direktem und indirektem Erregernachweis durchzuführen, um aktuelle Daten möglicher Infektionsquellen als Grundlage der Überwachung dieser Zoonose und effektiver Präventionsmaßnahmen gegen die Verbreitung des Q-Fieber-Erregers zu erhalten.
Weiteres Ziel ist es, empfindliche Labormethoden des Nachweises von Coxiella burnetii zu erarbeiten, die es dem CVUA Stuttgart ermöglich, Untersuchungen zur Überwachung von Schafherden wie auch im Falle von Q-Fieber-Erkrankungen durchführen zu können. Hierdurch sollen vorbeugende Maßnahmen sowie Maßnahmen im Q-Fieberfall zum Schutz von Mensch und Tier gezielter eingeleitet werden können. Diese Ziele wurden auch in einem Leitfaden und Maßnahmenkatalog formuliert, der auf der Grundlage eines Expertengesprächs im Ministerium für Ländlichen Raum Baden-Württemberg in Kooperation des Landesgesundheitsamtes Baden-Württemberg, des Schafherdengesundheitsdienst der Tierseuchenkasse Baden-Württemberg und des Chemischen und Veterinäruntersuchungsamtes Stuttgart erarbeitet worden ist.

Untersuchungsmethoden

• Nachweis von Coxiella brnetii in Schafvlies, Zecken und Zeckenkot mittels nested-PCR
• Sequenzierung der mittels PCR gewonnenen DNA-Amplifikate zur Bestätigung der PCR-Ergebnisse
• Nachweis von Antikörpern gegen Coxiella burnetii mit Hilfe der Komplementbindungs-reaktion (KBR) als klassischer serologischer Methode und vergleichend mit Hilfe eines selbsthergestellten empfindlichen ELISA-Tests

Ergebnis

Erregernachweis von C. burnetii mittels PCR

Nachweisgrenze der PCR

Als Nachweisgrenze der PCR konnten 102 bis 103 C. burnetii-Partikel ermittelt werden. Ein negativer Einfluss des Probenmaterials aus Zecken oder Zeckenkot auf die PCR konnte in keinem der Fälle nachgewiesen werden.

Nachweis von C. burnetii in Zecken und Zeckenkot

In einer der insgesamt 1066 in 23 Herden aus 22 Regionen in Baden-Württemberg gesammelten Zecke konnte aus einer Schafherde bei Efringen-Kirchen im Landkreis Lörrach (Regierungsbezirk Freiburg) konnte C. burnetii mittels PCR nachgewiesen werden. Dabei handelte es sich um eine ungesaugte Zecke. Ebenso ergaben die Untersuchungen bei einer der 48 aus 18 Herden gesammelten Zeckenkotproben aus dem Vlies von Schafen der oben genannten Schafherde ein positives Ergebnis (s. Abbildung 1, schwarzes Quadrat). 

Abbildung 1: Sammelorte von Zecken und Zeckenkot in Baden-Württemberg (markiert mit Quadrat- und Kreissymbolen).

Die Nukleotidsequenzen der PCR-Produkte (420 bp) aus einer Zecke und aus Zeckenkot zeigten eine vollständige Übereinstimmung mit den Sequenzen der positiven Kontrolle. Ein Abgleich dieser Nukleotidsequenzen mit anderen Sequenzen der Datenbank des Blast-Programms ergab Homologien zu bekannten Sequenzen von C. burnetii von 100%.

Serologische Untersuchungen

Komplementbindungsreaktion (KBR)

Von den insgesamt 3460 untersuchten Schafseren aus 4 den Regierungsbezirken Baden-Württembergs zeigten 18 Seren Titerstufen von 1:10 (positive Seren) und größer. Die Ergebnisse der Seren aus den einzelnen Regierungsbezirken sind in Tabelle 4 zusammengefasst dargestellt

Tabelle 4: Untersuchungen von Schafseren auf Antikörper gegen C. burnetii mittels KBR.

Die Untersuchungen der 100 Seren aus einer Q-Fieber-verdächtigen Schafherde ergaben bei insgesamt 6 (6%) der Seren KBR-Titerstufen von 1:10 und größer.

ELISA

Die Festlegung eines Cut off-Wertes für den ELISA wurde in Bezug auf die KBR-Ergebnisse vorgenommen. Eine Auswertung erfolgte mit Hilfe des Programms Win Epis-cope 2.0 (Thrusfield et al., 2001) und ergab bei Festlegung eines Cut off-Wertes von 0,4 eine Gesamtübereinstimmung von KBR und ELISA von 90,5%.
Die Ergebnisse der serologischen Untersuchungen der Schafseren aus den einzelnen Regierungsbezirken mittels ELISA stellen sich wie in der unten aufgeführten Tabelle 6 dar.

Tabelle 6: Untersuchungen von Schafseren aus den vier Regierungsbezirken Baden-Württembergs auf Antikörper gegen C. burnetii mittels ELISA.

Die Untersuchungen der 100 Seren aus einer Q-Fieber-verdächtigen Schafherde ergaben bei insgesamt 53 (53%) der Seren positive Ergebnisse.

Vergleich zwischen KBR und ELISA

Ein Vergleich zwischen KBR und ELISA wurde unter Berücksichtigung der erzielten Titerstufen durchgeführt. Hierbei zeigte sich einerseits, dass von 14 Seren mit niedrigen KBR-Titerstufen von 1:10 vier Seren Indexwerte von <0,4 im ELISA aufwiesen und somit als negativ zu bewerten waren. Andererseits wiesen 6 von 14 Seren hohe Indexwerte von >0,8 auf und konnten eindeutig als positiv bewertet werden. Seren hingegen mit KBR-Titerstufen von 1:20 und größer zeigten alle im ELISA Indexwerte von >0,4 und größer und somit eindeutig positive Reaktionen.
Betrachtet man die Seren (3202) mit negativem KBR-Ergebnis fällt auf, dass von diesen 334 im ELISA Indexwerte von >0,4 erreichten und als positive Reaktionen zu bewerten waren.

Konsequenzen für die Praxis

Gehäuft aufgetretene Q-Fieber-Epidemien beim Menschen in Baden-Württemberg (Kim-mig et al., 2000; Universitätsklinikum Tübingen, 2002) sowie Hessen und Nordrhein-Westfalen (Hellenbrand, 2001; Robert Koch-Institut, 2003a, 2003b) mit z.T. sehr schweren Krankheitsbildern rücken diese Epidemien in den Vordergrund unter den Zoonosen. Über eine Zunahme von Q-Fieber-Erkrankungen beim Menschen in den 90er Jahren berichten auch Hellenbrand et al. (2001) und Reintjes et al. (2000). Kröner (1995), Reintjes et al. (2000) und Schneider et al. (1993) gehen sogar von einer zunehmenden Gefahr von Q-Fieber-Infektionen in der Nähe städtischer Gebiet oder sogar Großstädten aus.
Durch solche Q-Fieber-Epidemien entsteht erhebliches Leiden bei den betroffenen Personen sowie Kosten für das öffentliche Gesundheitswesen. Neben diesen akuten Krankheitserscheinungen kommen die Folgen chronischer Q-Fieber-Erkrankungen hinzu, die sich z.T. als mit Todesfolgen einhergehende Endokarditisfälle darstellen (Fournier et al., 1998). Maurin und Raoult (1999) schätzen für Frankreich den durch Q-Fiberinfektionen bedingten Anteil an Endokarditisfällen auf sogar 5%. Q-Fieber-Infektionen beim Menschen sind überwiegend auf Kontakt mit Schafen, Damwild oder Zootieren zurückzuführen (Rolle und Mayr, 2002; Kimmig et al., 1997), wobei der vermehrte Kontakt zwischen Mensch und Schaf durch eine zunehmende Zersiedelung ländlicher Regionen zu einer Verschärfung der Situation führt (Hellenbrand et al., 2001). Im Infektionsgeschehen spielen Wanderschafherden eine besondere Rolle, so dass Infektionsquellen oftmals nicht mehr einer bestimmten Herde zugeordnet oder lokalisiert werden können. Um so wichtiger sind Untersuchungen zu möglichen Hauptinfektionsquellen sowie daraus resultierende Empfehlungen zu prophylaktischen Maßnahmen. Aus diesem Grunde wurden vom Ministerium für Ländlichen Raum Baden-Württemberg Untersuchungen zur Q-Fieber-Situation bei Schafen in Baden-Württemberg unterstützt.
Gebiete im südlichen Rheintal stellen sich nach wie vor als Endemiegebiet für C. burnetii-infizierte Zecken dar. Dies haben Untersuchungen von Zecken und Zecken-kot mittels PCR in dieser Arbeit gezeigt. Bereits 1978 konnte Liebisch in derselben Re-gion C. burnetii infizierte Zecken nachweisen. Auffallend war in unseren Untersuchungen, dass C. burnetii sowohl in einer ungesaugten Zecke als auch Zeckenkot, einer sehr wichtigen Infektionsquelle für den Menschen, nachgewiesen werden konnte. Durch eine transovarielle Übertragung des Erregers von Zecke zu Zecke und schließlich einer massenhaften Erregerausscheidung über Zeckenkot (Schliesser, 1991) ist über zeckenbefallene Schafe eine Erregerverbreitung und ein Kontakt des Erregers aus dem sog. Naturzyklus der Wildtiere (Babudieri, 1959) indirekt zum Menschen möglich. Einer Verbreitung von C. burnetii über das Vlies von Schafen, die in Wanderherden aus ihren Winterquartieren im Rheintal auf die Sommerquartiere der Schwäbischen Alb gelangen, leistet aufgrund des dort überwiegend ariden Klimas einer aerogenen Infektion Vorschub (Dedié und Bostedt, 1985; Hellenbrand et al., 2001; Marrie und Raoult, 1995; Tissot Dupont et al., 1999). Es ist somit davon auszugehen, dass auch ein geringer Anteil mit C. burnetii befallener Zecken in Schafherden aufgrund einer lebenslangen Persistenz des Erregers in Zecken sowie einer transovariellen Weitergabe des Erregers an die nächste Zeckengeneration, einer Virulenzsteigerung durch Zeckenpassagen (Brezina und Rehacek, 1961), einer massenhaften Erregerausscheidung über Zeckenkot von bis zu 1012 Keime pro Gramm (Liebisch, 1977; Nassal, 1982, Schliesser, 1991), der sehr hohen Tenazität von C. burnetii in der Umwelt (Ormsbee, 1972), und geringer Infektionsdosen von nur wenigen Keimen (Raoult und Marrie, 1997) zu einer effektiven Erregerausbreitung führen kann. Erschwerend könnte hinzukommen, dass eine Ausbreitung der Schafzecke in andere Gebiete zu befürchten ist. Aufgrund der in den letzten Jahren milden Winter wurde bereits über Zeckenbefall bei Schafen berichtet, die im Frühjahr nicht im Rheintal gewesen sind (persönliche Mitteilung eines Schafhalters). Die serologischen Untersuchungen zufällig entnommener Proben aus Schafherden zeigen unter Anwendung der KBR bei bis zu 1,4% und mittels ELISA bei bis zu 10,2% der Seren positive Ergebnisse. Hierbei ist zu beachten, dass 5 der 14 Seren mit KBR-Titerstufen von 1:10 Indexwerte im ELISA von <0,4 und 9 Indexwerte von >0,4 aufwiesen. Außerdem ließen sich Titerstufen von 1:10 im Gegensatz zu Titerstufen von >1:20 in Wiederholungsuntersuchungen nicht in jedem Fall bestätigen (Ergebnisse nicht dargestellt). Mölle und Hentschke (1993) beurteilen deshalb KBR-Titerstufen von 1:10 beim Schaf als negativ oder fraglich. So ließen sich auch bei Anwendung der ELISA-Technik nur 64,2% aller Seren mit KBR-Titerstufen von 1:10, hingegen alle KBR-Titerstufen von >1:20 als positive ELISA-Ergebnisse bestätigen. Dem entgegen zeigten auch in wiederholten Untersuchungen zahlreiche Seren (334), die in der KBR keine Titerstufen aufwiesen, im ELISA positive Reaktionen.
Ein Vergleich der serologischen Ergebnisse zufällig entnommener Proben und Proben aus einer Q-Fieberverdächtigen Herde zeigen deutliche Unterschiede. Während in Baden-Württemberg mit einer durchschnittlichen Seroprävalenz für Q-Fieber von 0,5% (0-1,4%) mittels KBR und von 8,7% (0,9-10,2%) mittels ELISA ausgegangen werden kann, fand sich in einem Q-Fieber-verdächtigen Betrieb eine Seroprävalenz von 6% (KBR) bzw. 53% (ELISA). Diese Ergebnisse zeigen, dass der ELISA-Technik aufgrund der höheren Sensitivität und besseren Reproduzierbarkeit der Ergebnisse für serologische Untersuchungen der Vorzug zu geben ist.
Auf der Grundlage der Ergebnisse dieser Arbeit lassen sich zu Untersuchungen in Q-Fieber-verdächtigen Herden, Prophylaxemaßnahmen und Kontrolluntersuchungen die im folgenden aufgeführten Empfehlungen aussprechen.

1. Untersuchungen in Q-Fieber-verdächtigen Herden:

• Untersuchungen von Zecken und Zeckenkot auf C. burnetii mittels PCR.
• Serologische Untersuchungen von Schafen: bei einer Seroprävalenz von >5% (KBR) oder >20% (ELISA) ist von Q-Fieber-Infektionen in einer Herde auszugehen.

2. Vorbeugende Maßnahmen gegen Q-Fieber-Infektionen:

• Zeckenbehandlung der Schafe in ihren Winterquartieren vor allem im südlichen Rheintal vor dem Aktivitätsgipfel der Schafzecken im zeitigen Frühjahr (Januar/Februar) mit Hilfe von langwirkenden Akaraziden.
• Oberflächendesinfektion mit Zeckenkot behafteter Schafe durch ein Oberflächendesinfektionsmittel in Form einer Badebehandlung.
• Scheren von Schafen unter besonderen Schutzmaßnahmen (Atemschutz, geschlossene Stallungen) bei Befall mit Zeckenkot und unschädliche Beseitigung mit Zeckenkot behafteter Schafwolle.
• Behandlung von Herden mit Q-Fieber bedingenten Aborten mit Tetrazyklinen zur Verringerung der Erregerausscheidung (persönliche Mitteilung, Steng, Schafherdengesundheitsdienst Stuttgart der Tierseuchenkasse Baden-Württemberg).
• Serologische Kontrolluntersuchungen neu zugekaufter Tiere mittels ELISA.

3. Weiterführende Untersuchungen:

• Gezielte Untersuchungen von Schafzecken aus Regionen des südlichen Rheintals zur Bestätigung eines dort möglichen stark ausgeprägten C. burnetii-Vorkommens bei dieser Zeckenart.
• Untersuchungen weiterer Zeckenarten wie Ixodes ricinus (gemeiner Holzbock).
• Auf Stichproben basierende Untersuchungen von Schafseren, die zur Brucellose-Untersuchungen entnommen werden mittels ELISA auf Q-Fieber, um bezüglich der Seroprävalenz des Q-Fiebers beim Schaf auf dem Laufenden zu bleiben.
• Sammlung von C. burnetii-Isolaten durch Anzüchtung des Erregers vor allem bei Q-Fieber-Ausbrüchen zum Zwecke von Stammcharakterisierungen (Zusammenarbeit mit dem nationalen Referenzlabor für Q-Fieber des Friedrich-Loeffler-Instituts - Bundesinstitut für Tiergesundheit -, Standort Wusterhausen/Dosse).

Literaturhinweise

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