Forschungsvorhaben
„Einführung der DNA-Chip-Technologie in der Lebensmittelanalytik"

Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg Dr. R. Renner

Juli 2002 - Juni 2004 (Arbeiten wurden im Juli 2003 abgeschlossen)

Kurzfassung:

Problemstellung:

Molekularbiologische Verfahren, in erster Linie die Polymerasekettenreaktion (PCR), werden zum Nachweis von gentechnisch veränderten Organismen in Lebensmitteln bereits erfolgreich eingesetzt. Mit Hilfe der Real-time PCR können Anteile an gentechnisch veränderter DNA und damit insbesondere Anteile an Bestandteilen aus gentechnisch veränderten Pflanzen (GVP) in Lebensmitteln quantifiziert werden. Die eingesetzten Verfahren erlauben jedoch i.d.R. nur den Nachweis einzelner DNA-Sequenzen. PCR-Verfahren, bei denen mittels Duplex- oder Multiplex-Systemen mehrere DNA-Sequenzen simultan nachgewiesen werden können, sind störanfälliger und i.d.R. weniger sensitiv als PCR-Methoden, die sich jeweils nur eines PCR-Primerpaars bedienen.

Mit den bisher eingesetzten, auf dem Nachweis weniger DNA-Sequenzen beruhenden Screening-Verfahren sind bereits jetzt eine Reihe von weltweit zugelassenen GVP nicht mehr erfassbar. Weiterhin ist bei positiven Befunden, die mit Screening-Verfahren erhalten wurden, eine Spezifizierung der GVP erforderlich Weltweit sind etwa 100 gentechnisch veränderte Pflanzen im Anbau. Mit Zunahme von GVP nimmt jedoch auch der Aufwand der Einzeluntersuchungen erheblich zu:

Ziel

Derzeit sind weltweit verschiedene Firmen an der Entwicklung sogenannter DNA-Microarrays beteiligt. Solche DNA-Chips sollen es ermöglichen, voraussichtlich einige hundert verschiedene DNA-Sequenzen parallel nachweisen können. Damit wird es beispielsweise erstmals möglich sein, in einer Probe gleichzeitig das Vorhandensein einer Vielzahl von DNA-Sequenzen aus GVO zu untersuchen. Erstmalig für den Lebensmittelbereich entwickelte die Fa. Genescan Europe in Freiburg zwei DNA-Chips annährend zur Vermarktungsreife. Im Rahmen des Forschungsvorhabens sollte - basierend auf bestehenden Kooperationen mit der Fa. Genescan – zunächst der sogenannte „GMOChip" zum simultanen Nachweis von DNA-Sequenzen, die für weltweit zugelassenen GVP charakteristisch sind, erprobt, validiert und ggf. in die Praxis der amtlichen Lebensmittelüberwachung eingeführt werden.

Untersuchungsmethoden

Unter DNA-Chips (Microarrays) versteht man miniaturisierte Träger, auf deren Oberflächen DNA-Moleküle bekannter Sequenz als biomolekulare Sonden in einem geordneten Raster immobilisiert oder synthetisiert sind. Die oberflächengebundenen DNA-Moleküle werden mit komplementären, markierten Nukleinsäuren hybridisiert. Die daraus resultierenden Signale erlauben eine rasche Aussage z.B. über vorhandene Sequenzen aus GVP. Veränderungen.

Durch eine hohe Parallelität des Verfahrens kann ein großer Datendurchsatz in kurzer Zeit erzielt werden. Zum Einsatz des sog. GMOChips beim Nachweis von DNA aus GVP muss zunächst DNA in ausreichender Menge aus der Probe extrahiert werden. Anschließend werden in zwei Multiplex-PCR 14 verschiedene DNA-Sequenzen amplifiziert. Durch Verwendung von modifizierten Nukleotiden in den Reaktionen werden die PCR-Produkte während der Amplifikation markiert. Nach Exonuklease-Verdau der Amplifikationsprodukte werden die generierten DNA-Einzelstränge auf dem GMO-Chip selektiv an räumlich getrennte Felder mit kovalent gebundenen DNA-Sonden, die für das jeweilige Nachweissystem spezifisch sind, hybridisiert. Die gebundenen DNA-Moleküle werden an den modifizierten Nukleotiden mit einem Fluoreszenzfarbstoff angefärbt, die jeweiligen Hybridisierungsereignisse können dann in einem geeigneten Biochip-Analysator detektiert werden. Die Methode eignet sich z.B. zum spezifischen Nachweis der GVP Roundup ReadyÔ Soja, Bt11 Mais, Bt176 MaximizerÔ Mais, MON810 YieldGardÔ Mais und Bt-XtraÔ (DBT418) Mais.

Ergebnis

Die Ergebnisse zeigen, dass der GMOChip in dem verwendeten Layout als erweitertes Screening-Nachweissytem eingesetzt werden kann. Vorhandene GVP werden i.d.R. zumindest über die Screening-Sequenzen detektiert, zumeist werden auch die konstrukt-spezifischen Sequenzen der enthaltenen GVP nachgewiesen. Optimierungsbedarf wird hinsichtlich der Sensitivität bei verarbeiteten Produkten (RRS-, Bt-176-Nachweis) sowie einzelnen Nachweis-Systemen gesehen. Unspezifische Signale wurden für Reis in Mais-haltigen Produkten festgestellt.

Das Layout des GMOChip kann gegenüber den vorhandenen PCR-Verfahren noch nicht als ausgereifte und routinegeeignete Alternative bezeichnet werden. Zur Absicherung positiver Signale und Befunde sind zusätzliche Untersuchungen mittels PCR und Real-time PCR erforderlich. Eine Absicherung ist insbesondere durch Event-spezifische PCR-Verfahren notwendig. Trotz unterschiedlicher Signalstärken auf dem GMOChip erlaubt das System keine quantitative Aussagen über den Gehalt des GMO in der Probe. Für quantitative Aussagen sind daher weitere Real-Time-PCR-Verfahren notwendig.

Konsequenz für die Praxis

Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigen, dass Microarray-Systeme prinzipiell sehr gut geeignet sind zur schnellen, parallelen und auch routinemäßigen Untersuchung von DNA-Extrakten (z.B. aus Lebensmitteln) auf vorhandene Sequenzen aus gentechnisch veränderten Organismen. Dem gegenüber steht jedoch eine eingeschränkte Differenzierungsmöglichkeit des GMOChips bei Vorhandensein verschiedener GMOs in einer Probe. Weitere PCR-Verfahren wären notwendig, um die verschiedenen GMO zu identifizieren. Für die rechtliche Beurteilung ist zudem erforderlich, quantitative Angaben über den nachgewiesenen GMO zu erhalten. Gegenwärtig sind entsprechende Chips, die für den Nachweis benötigt werden, nicht (mehr) kommerziell verfügbar. Ohne die Verfügbarkeit standardisierter, von spezialisierten Anbietern hergestellten Microarrays, ist eine Einführung von Microarray-Systemen in die Praxis der Lebensmittelüberwachung zur Zeit nicht realisierbar.

Während des Forschungsvorhabens wurde die Chip-Produktion des Kooperationspartners Fa. GeneScan, dem bis dahin einzigen Chip-Anbieter für die Lebensmittelanalytik, wieder eingestellt. Eine Weiterführung der Produktion entsprechender kommerzieller Microarray-Systeme (auch von anderen Anbietern) ist zur Zeit nicht absehbar.

Die noch nicht beherrschbaren Probleme, Microarray-Systeme in reproduzierbarer Qualität herzustellen, führten letztendlich zur Einstellung der Chip-Produktion bei der Fa. GeneScan.

Entsprechende Probleme, reproduzierbare Untersuchungsergebnisse zu erzielen, zeigten sich auch bei der Durchführung von Untersuchungen im Rahmen des Forschungsvorhabens. Da die Standardisierbarkeit von Methoden aber Grundvoraussetzung für die Anwendung in der Lebensmittelüberwachung ist, erscheint eine routinemäßige Anwendbarkeit solcher neuen Methoden noch verfrüht.

Literatur:
Abschlussbericht, Juli 2004

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