Forschungsreport
Transformation von Hopfen zur Verbesserung der Resistenz gegen Schadpilze

Förderkennzeichen: MLR 0149 E

Christoph Horlemann und Gerd Weber
Universität Hohenheim, Pflanzenzüchtung und Biotechnologie (350-c)
April 1999 - März 2003

Kurzfassung:

Problemstellung

Im Anbau von Hopfen (Humulus lupulus L.) kommt es zu erheblichen Ernteverlusten durch den Befall mit Pathogenen. Diese können zur Zeit nur durch den Einsatz von - meist präventiv ausgebrachten - Spritzmitteln bekämpft werden. Ökologisch und ökonomisch ist daher der Anbau widerstandsfähigerer Hopfensorten erstrebenswert.

Ziel

Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Systems zur effizienten Transformation von Hopfen, speziell der Sorte Tettnanger, um mit Hilfe dieses Systems Gene in Hopfen zu übertragen, die eine erhöhte Widerstandskraft gegen Pathogene induzieren.

Untersuchungsmethode

Für die Hopfensorte Tettnanger war bisher keine Methode zur de novo-Regeneration bekannt. Darüber hinaus gab es bisher noch keine publizierte Methode zur Transformation von Hopfen. Deshalb wurde wie folgt vorgegangen:

1. Entwicklung eines effizienten Systems zur de novo-Regeneration
2. Etablierung der Transformation mit Agrobacterium tumefaciens
3. Transformation mit Genen, die eine erhöhte Widerstandskraft induzieren

Ergebnisse

Folgende Ergebnisse konnten erzielt werden:

• Für die Sorte Tettnanger wurde eine optimierte Medienzusammensetzung zur de novo-Regeneration aus meristemfreiem Ausgangsgewebe entwickelt, mit der in hoher Frequenz (durchschnittlich 50%) Sprosse induziert werden konnten.
• Darauf basierend wurde ein einfaches und sehr effizientes Regenerationssystem entwickelt. Für alle Regenerationsstadien waren nur drei unterschiedliche Medien notwendig, um innerhalb von weniger als 6 Monaten aus Stängelstücken Pflanzen im Gewächshaus zu regenerieren (Regenerationsrate insgesamt mindestens 40%).
• Für die Etablierung der Transformation wurde ein Vektorsystem mit dem Reportergen uidA (bakterielle Glucuronidase; GUS) und dem Selektionsmarker nptII verwendet. Ausgehend von insgesamt 1.400 Stängelstücken gelang es, 83 Sprosse zu induzieren, die auf Selektion wuchsen. Von diesen waren 42 transgen für GUS. Insgesamt konnten 21 transgene Pflanzen im Gewächshaus angezogen werden. Der Erfolg der Transformation wurde durch PCR, Southern-Hybridisierung und GUS-Enzymtests verifiziert.
• Mehrere Parameter, die die Effizienz der Transformation beeinflussen können, wurden untersucht. Einen positven Einfluss auf die Transformation hatten im wesentlichen:
• • eine Vakuuminfiltration der Explantate zusammen mit A. tumefaciens
  • eine Induktion von A. tumefaciens (Absenkung des pH-Wertes, Acetosyringone)
  • der Zusatz von Acetosyringone zum Cokulturmedium.
• Zur Erhöhung der Widerstandskraft der Sorte Tettnanger wurden drei verschiedene Gene ausgewählt: Stilbensynthase, NPR1 und Fragmente aus dem Gen T4-Lysozym. Die Gene wurden aufbereitet und in ein binäres Vektorsystem vor einen 2x35S-Promotor kloniert.
• Vor allem Konstrukte mit Stilbensynthase wurden für die Transformation von mehr als 4.000 Stängelstücken verwendet. Mehrere transgene Pflanzen konnten regeneriert werden. Eine detaillierte Analyse dieser transgenen Pflanzen wird zur Zeit durchgeführt.

Konsequenzen für die Praxis

Im Rahmen dieser Arbeit ist es erstmals gelungen, ein System für die stabile und routinemäßige Genübertragung bei Hopfen zu etablieren und transgene Hopfenpflanzen herzustellen. Gene zur Erhöhung der Widerstandskraft gegen Pathogene wurden in Hopfen übertragen. Die hier erstmalig etablierte Transformationstechnik für Hopfen kann jetzt zur Übertragung weiterer Gen genutzt werden, die Resistenzen gegen Schadpilze und Insekten verbessern. Transgene Pflanzen können darüber hinaus in bestehende Züchtungsprogramme integriert werden.

Literatur:

• Horlemann, C. (2003) Transformation und Regeneration von Hopfen (Humulus lupulus L.) Dissertation, Universität Hohenheim (Verfahren läuft)
• Horlemann, C. und Weber, G. (2002) Transformation der Hopfensorte Tettnanger zur Erhöhung der Resistenz gegen Pathogene. Vortr. Pflanzenzüchtg. 54, 353-355.
• Horlemann, C. und Weber G. (2001) Towards the regeneration and transformation of hop. Proceedings of the Scientific Commission, International Hop Grewers' Convention. Canterbury, Kent, England. 12-15.
• Horlemann, C., Schwekendiek, A., Höhnle, M. und Weber, G. (2003) Regeneration and Agrobacterium-mediated transformation of hop (Humulus lupulus L.). Plant Cell Reports (im Druck)
• Fleischer, R., Horlemann, C., Kling, C., und Weber, G. (2003) AFLP fingerprinting in hop: analysis of the genetic variability of the Tettnang variety. Genet. Resour. Crop. Evol. (im Druck)
• Horlemann, C., Schwekendiek, A., Fleischer, R., Höhnle, M. und Weber, G. (2003) Transformation of hop (Humulus lupulus L.) for an increased resistance against pathogens. Proceedings of the Scientific Commission, International Hop Grewers' Convention (im Druck)

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